کیت تشخیص مولکولی مولتیپلکس کرونا LIFESINA MULTI COVID-19 بر پایه REAL-TIME PCR

هدف

بیماری کرونا ویروس ۲۰۱۹ (COVID-19) برای اولین بار در دسامبر 2019 در شهر ووهان چین گزارش شد که منجر به گسترش در جهان و پاندمی گردید. این عارضه یک بیماری عفونی است که منجر به سندرم حاد دیسترس تنفسی کوروناویروس۲ (SARS_COV-2) می گردد. علائم شایع آن شامل تب ، سرفه و تنگی نفس می باشد. دیگر علائم می تواند شامل درد عضلانی، خلط، اسهال، گلودرد، اختلال بویایی و درد شکمی باشد. در حالیکه در بیشتر موارد ممکن است فرد بدون علامت و یا با علائم خفیف بروز کند، در برخی موارد ممکن است به سمت پنومونی و یا نارسایی ارگانهای مختلف منجر شود. طبق راهنمای WHO اولویت تشخیص این ویروس با استفاده از Real-time PCR و شناسایی ژن E یا N و تایید آن با بررسی ژن RdRP است.کیت حاضر برای تشخیص مولکولی همزمان ژنهای E و RdRP ویروس COVID-19 در یک تیوب بوسیله Real-time PCR و با استفاده از پروب Taqman می باشد.

روش کار

طراحی این کیت بصورت One Step است و مستر میکس موجود در کیت حاوی یک سوپر میکس ویژه جهت تکثیر اختصاصی RNA ویروسی است. مرحله اول رونویسی معکوس (RT) است که طی آن ویروس RNA به cDNA رونویسی می شود. پس از آن ، از یک آنزیم Taqپلیمراز مقاوم به دما برای تکثیر قطعات ژنی E و RdRP با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) استفاده می شود که شناسایی این قطعات ژنی تکثیر شده به ترتیب در کانالهای FAM و HEX انجام خواهد شد. به سهولت مطابق پروتکل، میکس qPCR و RT Enzyme آماده شده و سپس RNA استخراج شده به واکنش اضافه می¬گردد. به عنوان کنترل داخلی، پروب و پرایمرهای ویژه ژن RNaseP انسانی برای تایید صحت نمونه گیری، استخراج RNA و سنتز cDNA در هر واکنش و در کانال ROX عمل می¬کند.

اجزای کیت

# اجزا کیت 10 واکنشی کیت ۴۸ واکنشی کیت ۹۶ واکنشی
1 COVID-19 qPCR Mix (2X) 100 μl 480 μl 2 × 480 μl
2 RT Enzyme Mix 10 μl 48 μl 96 μl
3 Positive Control 10 μl 20 μl 30 μl
4 Nuclease-free water 100 μl 250 μl 500 μl

شرایط نگهداری کیت

  • کیت بر روی یخ خشک حمل شود.
  • تمام اجزای کیت پس از دریافت در دمای بین 25- تا 15- درجه سانتیگراد نگهداری شوند.
  • از ذوب و انجماد اجزای کیت بطور مکرر اجتناب گردد زیرا این امر می¬تواند بر عملکرد و حساسیت سنجش تاثیر بگذارد.
  • ذخیره کیت در دمای بین 2 تا 8 درجه سانتیگراد نباید بیش از مدت زمان دو ساعت باشد.
  • میکس qPCR محتوی پروب در برابر نور محافظت گردد.
  • همه اجزای کیت می¬توانند تا تاریخ انقضا چاپ شده بر روی برچسب کیت استفاده شوند.
  • تمامی محلولهای کیت در طول مراحل کاری با قرار دادن بر روی یخ یا رکهای خنک کننده، نگهداری گردند.
  • پس از آماده سازی معرف های کار، تمام اجزای کیت را به شرایط صحیح ذخیره سازی برگردانید.
  • محلولها و بافرهای کیتهای متفاوت و بچ های مختلف با هم مخلوط نشود.

هشدارها و اقدامات احتیاطی

  • کلیه نمونه های بیمار و کنترل های مثبت باید بعنوان عامل عفونی در نظر گرفته شوند و بر این اساس برخورد شود.
  • معرفهای ارائه شده بطور اختصاصی برای استفاده با این کیت تنظیم شده اند. برای اطمینان از عملکرد بهینه کیت، هیچ تعویض یا رقیق¬سازی انجام نشود. رقیق شدن بیشتر معرفها یا تغییر در زمان و دمای واکنش ممکن است منجر به داده های نادرست یا متناقض شود.
  • تمام آزمایشات در شرایط استریل مناسب با استفاده از تکنیک¬های آسپتیک انجام گیرد و در کل انجام مراحل تست لباس های محافظ شخصی از جمله دستکش یکبار مصرف استفاده گردد.
  • ذدو منطقه کاری جداگانه تنظیم شود: 1) اتاق استخراجRNA و 2) اتاق تکثیر و تشخیص محصولات PCR.
  • پیپت ها، ویال ها و سایر مواد کار نباید در بین واحدهای کاری گردش کنند.
  • همیشه از پیپت استریل فیلتردار استفاده شود.
  • در هر قسمت روپوش و دستکش جداگانه پوشیده شود.

تهیه و حمل و نقل نمونه‌ مشکوک به بیماری

  • جمع آوری: نمونه مجاري تنفسي فوقاني شامل سواب نازوفارنژيال يا سواب اوروفارنژيال و نمونه مجاري تنفسي تحتاني شامل خلط/ خلط القايي، آسپيره اندوتراكئال و لاواژ برونكوآلوئولار است. جهت افزايش احتمال شناسايي ويروس، نمونه¬گیری همزمان دو سواب نازوفارنژيال و اوروفارنژيال و قرار دادن هر دو نمونه در يك لوله توصيه ميشود. سواب ها باید بلافاصله درون یک لوله حمل و نقل استریل که حاوی 2-3 میلی لیتر از محيط مخصوص حمل و نقل ویروسی (VTM)، محیط حمل و نقل Amies یا بافر نمکی استریل قرار گیرند.
  • ذخیره: : نمونه ها می توانند تا 72 ساعت پس از جمع آوری در دمای 2-8 درجه سانتیگراد نگهداری شوند، در صورت تاخیر در استخراج، نمونه ها در دمای70- درجه سانتیگراد یا پایین تر ذخیره گردند. RNA استخراج شده باید در دمای 70- درجه سانتیگراد یا پایین تر ذخیره شود.
  • :انتقال نمونه ها در دمای 2-8 درجه سانتیگراد ذخیره کرده روی بسته یخ ارسال گردد. اگر نمونه ای در دمای 70- درجه سانتیگراد یا پایینتر یخ زده باشد، نمونه بر روی یخ خشک ارسال شود.

مواد و تجهیزات موردنیاز

  • دستگاه Real-time PCR
  • کابینت بیولوژیکی یا هود لامینار کلاس II
  • ورتکس میکسر
  • سرسمپلرهای فیلتردار استریل
  • دستکش یکبار مصرف بدون پودر و گان
  • رک خنک کننده مخصوص Real-time PCR
  • محلول 10٪ سفید کننده (رقت 1:10 هیپوکلریت تجاری)
  • یخچال و فریزر
  • پیپت (0.5-1000 μl)
  • ظرف زباله Biohazard
  • رک تیوب
  • تیوب 0.2 میکرولیتر/ پلیت واکنش Real-time PCR

تست ویژگی

  • انجام این تست فقط برای ویروس Covid-19 مثبت خواهد بود. پرایمرها و پروب های طراحی شده جهت بررسی همولوژی احتمالی با تمام توالی های منتشر شده در Genbank با استفاده از تجزیه و تحلیل BLAST بررسی شدند تا از هرگونه همسانی با موجودات دیگر جلوگیری شود. به منظور بررسی ویژگی این کیت، RNA های نرمال / سالم بیش از ۱۰۰ نفر مختلف مورد بررسی قرار گرفت که در هيچ يك از اين نمونه ها پیک مثبت مشاهده نگردید.

تست حساسیت

  • ن کیت قادر به تشخیص حداقل ۱۰ کپی از مولکول هدفدر هر واکنش با احتمال ۹۹ درصد و یک کپی با احتمال ۵/۹۳ درصد میباشد. این حساسیت بر اساس تهیه سریال رقت کنترل مثبت از ۱۰ هزار الی ۱ کپی در واکنش بوده است.

روش آماده سازی نمونه

  • الف- استخراج RNA
  • استخراج RNA ماده اولیه برای کیت حاضرمی¬باشد. کیفیت RNA استخراج شده تأثیر فراوانی بر عملکرد کل سیستم تست دارد. توصیه می شود که سیستم مورد استفاده برای استخراج اسید نوکلئیک با فناوری Real-time PCR سازگار باشد. استخراج RNA مطابق با پروتکل کیت مورد استفاده انجام گیرد.
  • ب- تهیه مستر میکس (مخلوط واکنش)
  • برای تهیه مستر میکس به ازای هر نمونه ۱۰ ماکرولیتر COVID-19 qPCR Mix (2X) و یک ماکرولیتر RT Enzyme Mix به تیوب اضافه کنید.
  • مقدار ۱۱ ماکرولیتر از مخلوط آماده شده را به هر تیوب PCR تقسیم و سپس در اتاقی مجزا ۹ میکرولیتر RNA نمونه مشکوک اضافه شود و در پایان برای جمع آوری محتویات در انتهای لوله¬ها، چند ثانیه اسپین گردد. لازم به ذکر است در صورتی که حجم RNA اضافه شده به هر تیوب کمتر از ۹ میکرولیتر است حجم نهایی هر تیوب با آب عاری از نوکلئاز به ۲۰ میکرولیتر برسد.
  • اطمینان حاصل کنید که در هر ران از Real-time PCR، حداقل یک کنترل مثبت و یک کنترل منفی استفاده می شود.
# نمونه فرد مشکوک کنترل مثبت کنترل منفی
1 COVID-19 qPCR Mix (2X) 10 μl 10 μl 10 μl
2 RT Enzyme Mix 1 μl - -
3 Sample RNA * 9 μl - -
4 Positive Control - 3 μl -
5 Nuclease-free water Up to 20 μl Up to 20 μl Up to 20 μl
  • مقدار RNA مورد استفاده به کیفیت RNA استخراج شده وابسته است، چنانچه کیفیت RNA استخراج شده از نظر نسبت 280/260 و 230/260 مناسب نیست از مقدار RNA کمتری در واکنش استفاده گردد.

برنامه PCR

برای اجرای برنامه ابتدا کانالهای سبز، زرد و نارنجی را انتخاب نموده و سپس برنامه PCR طبق جدول زیر اجرا گردد.

# دما زمان سیکل
1 42◦C 25 min 1
2 95◦C 5 min 1
3 94◦C 10 sec 45 - 50
4 58◦C 45 sec 45 - 50
# Name of Channel Excitation wavelength (nm) Emission wavelength (nm)
1 FAM (E gene) 494 516
2 HEX (RdRP gene) 520 548
3 ROX (Internal Control) 576 601

تحلیل نتایج

  • نمونه هایی مثبت تلقی می¬شوند که منحنی Real-time PCR آنها بصورت سیگموییدی تکثیر شده باشد.
  • NTC در واکنشهای RT-PCR شامل استفاده از آب عاری از نوکلئاز به جای RNA است. واکنشهای NTC برای تمامی مجموعه های پرایمر و پروب نباید منحنیهای افزایش فلورسانس را که از خط آستانه عبور می¬کنند، نشان دهند. اگر هر یک از واکنشهای NTC دارای یک منحنی سیگموییدی با Ct≤35 باشد که از خط آستانه عبور کند، ممکن است آلودگی نمونه رخ داده باشد. در این صورت نتایج بی اعتبار بوده و نیاز به تکرار مجدد تست با رعایت دقیق دستورالعمل ها می¬باشد.
  • نمونه ¬هایی مثبت تلقی می¬شوند که منحنی Real-time PCR آنها بصورت سیگموییدی تکثیر شده باشد.
  • از آنجا که سیگنال ROX منفی مانع از وجود RNA ویروسnCoV-2019 در یک نمونه بالینی نمی شود، لذا تکثیر اینترنال کنترل در کانال ROX در صورت نتایج مثبت در کاناهای FAM و HEX، قطعی و لازم نیست. عدم تکثیر در کانال ROX می¬تواند به دلایل مختلفی مانند استخراج نادرست RNA از نمونه، تنظیم و اجرای نامناسب تست، نبود سلول انسانی کافی در اثر نمونه¬گیری ضعیف و یا از بین رفتن تمامیت نمونه باشد.
  • بر مبنای پروتکلهای WHO، نخست آزمون غربالگری برای تایید وجود ژن E و در مرحله بعد آزمون تاییدی نهایی برای تایید وجود ژن RdRP انجام می¬گیرد که در این کیت سنجش همزمان دو ژن E و RdRP با کارایی بالا انجام می¬گیرد.
  • با توجه به حساسیت نسبتا متفاوت سیستم های تشخیص برای ژنهای E و RdRP، در موارد نادر نمونه های مثبت ضعیف ممکن است سیگنال را در ژن E نشان دهند اما در ژن RdRP نشان ندهند و یا بالعکس. در این صورت بهتر است آزمون یکبار دیگر تکرار گردد. چنانچه مجددا همان نتایج دیده شد نمونه برای nCoV-19 مثبت است.
  • اگر در نمونه بیمار هیچ سیگنالی در سه کانال مشاهده نشود نتیجه تست نامعتبر است. در این صورت اگر از نمونه¬ی بیمار باقیمانده است، بایستی روش استخراج و تست Real-time PCR مجددا تکرار شود. در صورتی که همان نتایج دیده شد نتیجه بصورت نامعتبر اعلام و در صورت امکان نمونه جدید جمع¬آوری گردد.
  • # کانال FAM (ژن E) کانال HEX (ژن RdRP) کانال ROX (IC) کنترل مثبت کنترل منفی نتیجه
    1 ≥40 ≥40 ≥40 ≥30 - مثبت
    2 - - ≥40 ≥30 - منفی
    3 ≥40 ≥40 - ≥30 - مثبت
    4 - - - ≥30 - نیاز به تکرار تست/ استخراج RNA
    5 ≥40 ≥40 ≥40 ≥30 ≥35 نامعتبر/ نیاز به تکرار تست

تماس با شرکت سیناکلون

لطفا جهت خرید و مشاوره علمی به وب سایت شرکت سیناکلون مراجعه فرمایید.