کیت تشخیص مولکولی COVID-19 LIFESINA COVID-E REAL-TIME PCR KIT/ TAQMAN PROBE

هدف

بیماری کرونا ویروس ۲۰۱۹ (COVID-19) برای اولین بار در دسامبر 2019 در شهر ووهان چین گزارش شد که منجر به گسترش در جهان و پاندمی گردید. این عارضه یک بیماری عفونی است که منجر به سندرم حاد دیسترس تنفسی کوروناویروس۲ (SARS-COV-2) می گردد. علائم شایع آن شامل تب ، سرفه و تنگی نفس می باشد. دیگر علائم می تواند شامل درد عضلانی، خلط، اسهال، گلودرد، اختلال بویایی و درد شکمی باشد. در حالیکه در بیشتر موارد ممکن است فرد بدون علامت و یا با علائم خفیف بروز کند، در برخی موارد ممکن است به سمت پنومونی و یا نارسایی ارگانهای مختلف منجر شود. طبق راهنمای WHO اولویت تشخیص این ویروس با استفاده از Real-time PCR و شناسایی ژن E یا N و تایید آن با بررسی ژن RdRp است. کیت حاضر برای تشخیص مولکولی ژن E ویروس COVID-19 به وسیله Real-time PCR و پروب Taqman طراحی شده است. این کیت بصورت One Step طراحی شده و کافی است ابتدا طبق پروتکل میکس آماده و RNA استخراج شده به واکنش اضافه گردد. به عنوان کنترل داخلی، پروب و پرایمرهای ویژه ژن RNase P انسانی برای تایید صحت نمونه گیری و استخراج در هر واکنش عمل می کند.

اجزای کیت

# اجزا کیت 24 واکنشی کیت ۴۸ واکنشی کیت ۹۶ واکنشی
1 E-nCOV PCR Mix (2X) 300 μl 600 μl 1200 μl
2 Reverse Transcriptase 12.5 μl 25 μl 50 μl
3 Positive Control 20 μl 30 μl 50 μl
4 Nuclease-free water 250 μl 500 μl 1000 μl

شرایط نگهداری کیت

  • کیت بر روی یخ خشک حمل شود.
  • تمام اجزای کیت پس از دریافت در دمای بین 25- تا 15- درجه سانتیگراد نگهداری شوند.
  • از ذوب و انجماد اجزای کیت بطور مکرر اجتناب گردد زیرا این امر می¬تواند بر عملکرد و حساسیت سنجش تاثیر بگذارد.
  • ذخیره کیت در دمای بین 2 تا 8 درجه سانتیگراد نباید بیش از مدت زمان دو ساعت باشد.
  • ویالهای محتوی پروب در برابر نور محافظت گردند.
  • همه اجزای کیت می¬توانند تا تاریخ انقضا چاپ شده بر روی برچسب کیت استفاده شوند.
  • تمامی محلولهای کیت در طول مراحل کاری با قرار دادن بر روی یخ یا رکهای خنک کننده، نگهداری گردند.
  • پس از آماده سازی معرف های کار، تمام اجزای کیت را به شرایط صحیح ذخیره سازی برگردانید.
  • محلولها و بافرهای کیتهای متفاوت و بچ های مختلف با هم مخلوط نشود.

هشدارها و اقدامات احتیاطی

  • لباس های محافظ شخصی از جمله دستکش یکبار مصرف را در کل انجام مراحل تست بپوشید.
  • دو منطقه کاری جداگانه را تنظیم کنید: 1) استخراج RNA و 2) تکثیر و تشخیص محصولات PCR.
  • سمپلرها، ویال ها و سایر مواد کار نباید در بین واحدهای کاری گردش کنند.
  • همیشه از نوک سمپلر استریل فیلتردار استفاده کنید.
  • در هر قسمت روپوش و دستکش جداگانه بپوشید.
  • کلیه نمونه های بیمار و کنترل های مثبت باید بعنوان عامل عفونی در نظر گرفته شوند و بر این اساس برخورد شود.
  • .معرفهای ارائه شده بطور اختصاصی برای استفاده با این کیت تنظیم شده اند. برای اطمینان از عملکرد بهینه کیت، هیچ تعویض یا رقیق¬سازی ایجاد نکنید. رقیق شدن بیشتر معرفها یا تغییر در زمان و دمای واکنش ممکن است منجر به داده های نادرست یا متناقض شود
  • تمام آزمایشات را در شرایط استریل مناسب با استفاده از تکنیک های آسپتیک انجام دهید.

مواد و تجهیزات موردنیاز

  • تیوب / پلیت واکنش Real-time PCR
  • سمپلر (0.5-1000 μl)
  • میکروتیوب استریل
  • ظرف زباله Biohazard
  • رک تیوب
  • دستگاه Real-time PCR
  • کابینت بیولوژیکی یا هود لامینار کلاس II
  • ورتکس میکسر
  • نوک سمپلرهای فیلتردار استریل
  • دستکش یکبار مصرف بدون پودر
  • یخچال و فریزر

تست حساسیت

  • این کیت قادر به تشخیص حداقل ۱۰ کپی از مولکول هدف میباشد. این حساسیت بر اساس تهیه سریال رقت کنترل مثبت از ۱۰ هزار الی ۱۰ کپی در واکنش بوده و بررسیهای دقیق نشان داد که احتمال موفقیت تشخیص کیت در این رنج، بالای ۹۵ درصد است.

روش آماده سازی نمونه

  • الف- استخراج RNA
  • استخراج RNA ماده اولیه برای کیت حاضرمی¬باشد. کیفیت RNA استخراج شده تأثیر فراوانی بر عملکرد کل سیستم تست دارد. توصیه می شود که سیستم مورد استفاده برای استخراج اسید نوکلئیک با فناوری Real-time PCR سازگار باشد. استخراج RNA مطابق با پروتکل کیت مورد استفاده انجام گیرد. می توانید از کیت استخراج ویروس سیناکلون (Cat No.:EX6061) SinaPure Viral استفاده کنید.
  • ب- تهیه مستر میکس (مخلوط واکنش)
  • تمامی معرف ها و نمونه ها باید کاملاً ذوب شده و با استفاده از پیپتینگ یا ورتکس ملایم مخلوط شوند و قبل از استفاده به طور مختصر سانتریفیوژ شوند.
  • به ازای هر نمونه بیمار، یک میکروتیوب مخصوص Real-time PCR لیبل شود و در داخل یک تیوب جداگانه به ازای تعداد نمونه¬های بیمار، مقدار مورد نیاز از میکس 2X اضافه شود. لازم به ذکر است مقادیر اضافی از مخلوط واکنش 2X باید برای خطای پیپتینگ در نظر گرفته شود. به تعداد تیوبهای لیبل شده مقدار 0.5 µl آنزیم ریورس به مستر میکس اضافه و بخوبی مخلوط گردد.
# نمونه فرد مشکوک کنترل مثبت کنترل منفی
1 E-nCOV PCR Mix (2X) 12.5 μl 12.5 μl 12.5 μl
2 Reverse Transcriptase 0.5 μl - -
3 Sample RNA 5-12 μl - -
4 Positive Control - 2 μl -
5 Nuclease-free water Up to 25 μl Up to 25 μl Up to 25 μl
  • مقدار ۱۳ میکرولیتر از مخلوط آماده شده به هر تیوب تقسیم شده و سپس در اتاقی مجزا 12-5 میکرولیتر RNA بیمار به هر تیوب اضافه کرده و در پایان برای جمع آوری محتویات در انتهای لوله¬ها، 5 ثانیه سانتریفیوژ گردد. لازم به ذکر است در صورتی که حجم RNA اضافه شده به هر تیوب کمتر از ۱۲ میکرولیتر است حجم نهایی هر تیوب با آب عاری از نوکلئاز به ۲۵ میکرولیتر برسد.
  • اطمینان حاصل کنید که در هر ران از Real-time PCR، حداقل یک کنترل مثبت و یک کنترل منفی استفاده می شود. مقدار ۲ میکرولیتر از تیوب کنترل مثبت کافیست.
  • اینترنال کنترل در کانال HEX خوانش می¬گردد و تکثیر آن کیفیت RNA استخراجی را نشان می دهد.

برنامه PCR

برای اجرای برنامه ابتدا کانالهای سبز وزرد را انتخاب نموده و سپس برنامه PCR طبق جدول زیر اجرا گردد.

# دما زمان سیکل
1 42◦C 25 min 1
2 95◦C 5 min 1
3 95◦C 15 sec 45 - 50
4 58◦C 45 sec 45 - 50
# Name of Channel Excitation wavelength (nm) Emission wavelength (nm)
1 FAM (Target) 494 516
2 YELLOW (Internal Control) 520 548

تحلیل تنایج

  • بر مبنای پروتکلهای WHO، نخست آزمون غربالگری برای تایید وجود ژن E و در مرحله بعد آزمون تاییدی نهایی برای تایید وجود ژن RdRp انجام می گیرد.
  • نمونه ¬هایی مثبت تلقی می شوند که منحنی Real-time PCR آنها بصورت سیگموییدی تکثیر شده باشد.
  • تکثیر اینترنال کنترل در کانال تشخیص FAM برای نتایج مثبت، قطعی و لازم نیست.
  • با توجه به حساسیت نسبتا متفاوت سیستم های تشخیص برای ژنهای E و RdRp، در موارد نادر نمونه های مثبت ضعیف ممکن است سیگنال را در ژن E نشان دهند اما در ژن RdRp نشان ندهند. در این صورت بهتر است آزمون یکبار دیگر تکرار گردد. چنانچه مجددا همان نتایج دیده شد نمونه برای nCoV-19 مثبت است.
  • # کانال سبز (ژن E ) کانال زرد (IC) کنترل مثبت کنترل منفی نتیجه
    1 + + + - مثبت
    2 - + + - منفی
    3 + - + - مثبت
    4 - - + - نیاز به تکرار تست/ استخراج RNA
    5 + + + + نامعتبر/ نیاز به تکرار تست

تماس با شرکت سیناکلون

لطفا جهت خرید و مشاوره علمی به وب سایت شرکت سیناکلون مراجعه فرمایید.